נובל לכימיה 2014: כיצד הפך המיקרוסקופ האופטי לננו-סקופ

בעזרת השימוש במולקולות פלואורסנטיות, מדענים יכולים כיום לנטר את יחסי-הגומלין שבין מולקולות פרטניות בתוך התאים: הם יכולים לצפות בחלבונים המעורבים בהתפתחות מחלות בזמן הצטברותם יחדיו והם יכולים לעקוב אחר חלוקת התא ברמה הננומטרית.

אריק בטזיג, וויליאם מורנר וסטפן הל זוכים בפרס הנובל לכימיה לשנת 2014 בזכות תרומתם להתגברות על מגבלה מדעית שגרסה כי מיקרוסקופ אופטי לעולם לא יוכל להוליד כושר הפרדה גבוה יותר מ-0.2 מיקרומטרים. בעזרת השימוש במולקולות פלואורסנטיות, מדענים יכולים כיום לנטר את יחסי-הגומלין שבין מולקולות פרטניות בתוך התאים: הם יכולים לצפות בחלבונים המעורבים בהתפתחות מחלות בזמן הצטברותם יחדיו והם יכולים לעקוב אחר חלוקת התא ברמה הננומטרית.

תאי דם אדומים, חיידקים, שמרים ותאי זרע. כאשר מדענים במאה ה-17 החלו לבחון לראשונה יצורים חיים מתחת למיקרוסקופ אופטי, נגלה לעיניהם עולם חדש ומרתק. נקודת זמן זו הייתה לידתה של המיקרוביולוגיה, ומאז ועד היום, המיקרוסקופ האופטי הפך לאחד מהכלים החשובים ביותר בארגז הכלים של הביולוגיים. שיטות מיקרוסקופיות אחרות, למשל, מיקרוסקופיה אלקטרונית, חייבו ביצוע מדידות הרסניות בדגימות שהביאו למות התא.

בשנת 1873, מומחה המיקרוסקופיה הגרמני ארנסט אבה פרסם משוואה הקובעת כיצד כושר ההפרדה של מיקרוסקופ מוגבל ע”י, בין שאר הדברים, אורך הגל של האור. במשך מרבית השנים במאה העשרים המדענים הגיעו למסקנה בעקבות פרסום זה כי כושר ההפרדה של מיקרוסקופ אופטי לא יהיה טוב יותר מאשר 0.2 מיקרומטרים (איור 1). שלושת החוקרים זכו בפרס השנה בזכות ההתגברות על מגבלה זו. בזכות ההישגים שלהם המיקרוסקופ האופטי נכנס עתה לעולם הננומטרי. קווי-המתאר של חלק מהאברונים שבתא, לדוגמה, המיטוכונדריה, היו ניתנים לצפייה. אולם, לא היה אפשרי להבחין בעצמים קטנים יותר, לדוגמה, לעקוב אחר יחסי-הגומלין שבין מולקולות חלבון פרטניות בתוככי התא. זה דומה למצב שבו אנו יכולים לראות את הבניינים של עיר מבלי להיות מסוגלים להבחין בתושביה של העיר ובמהלכיהם על מנת להבין כהלכה ובאופן מלא את הפונקציות של התא, אתה צריך להיות מסוגל לעקוב אחר פעילותן של המולקולות הפרטניות. הגם שהמשוואה שפיתח אבה שרירה וקיימת, נמצאו דרכים לעקוף אותה. זוכי פרס הנובל לכימיה לשנת 2014, אריק בטזיג, וויליאם מורנר וסטפן הל הכניסו את המיקרוסקופיה האופטית לממד חדש, הממד הננומטרי, בעזרתן של מולקולות פלואורסנטיות. מבחינה תיאורטית, לא קיים יותר מבנה כלשהו שהוא קטן מכדי שיהיה ניתן לבחון אותו. כתוצאה מכך, המיקרוסקופיה הפכה לננוסקופיה.

סיפור ההתגברות על המגבלה של אבה נע על שני צירים נפרדים – הזכייה הוענקה עבור שני עקרונות נפרדים שפותחו במנותק זה מזה. הסיפור מתחיל בשנת 1993 בדירת סטודנט בדרום מערב פינלנד, כאשר סטפן הל הגה רעיון גאוני בעודו מדפדף בספר לימוד בנושא אופטיקה קוונטית.

מרד הנעורים כנגד מגבלת ההשתברות של אבה

סטפן ניסה למצוא דרך לעקוף את המגבלה שקבע ארנסט אבה יותר ממאה שנים קודם לכן. הנכונות לאתגר עיקרון כה מבוסס היה מפתה בעיניו של סטפן. אולם, מדענים בכירים בגרמניה שפכו מים קרים על ההתלהבות שלו ולכן הוא נמלט צפונה, למקום קר יותר. פרופסור באוניברסיטת טורקו שעבד על מיקרוסקופיה פלואורסנטית הציע לו משרה בצוות המחקר שלו. הל היה משוכנע כי חייבת להיות דרך להתגבר על מגבלת ההשתברות של אבה, וכאשר הוא קרא את המונח פליטה מאולצת בספר האופטיקה הקוונטית עלה במוחו רעיון חדשני, אי-אז בשנת 2009.

הפיתרון שלו: “פנס” ננומטרי הסורק את הדגימה

במעבדתו החדשה סטפן עסק בתחום של מיקרוסקופיה פלואורסנטית, שיטה שבמסגרתה מדענים משתמשים במולקולות פלואורסנטיות על מנת לבצע דימות של חלקים בתא. לדוגמה, הם יכולים להשתמש בנוגדנים פלואורסנטיים הנקשרים באופן בררני לדנ”א תאי. המדענים מעוררים אלקטרונית את הנוגדנים בעזרת הבזק אור קצרצר, וגורמים להם לזהור להרף עין. אם הנוגדנים קשורים לדנ”א הם יזהרו ממרכז התא, שם הדנ”א דחוס בגרעין התא. בדרך זו, מדענים יכולים לראות מהו מיקומה המדויק של מולקולה. אולם, בשלב זה המדענים הצליחו למקם רק צברים של מולקולות, כדוגמת גדילים שזורים של דנ”א. כושר ההפרדה היה נמוך מכדי להבדיל בין גדילי דנ”א נפרדים – נסו לדמיין שאתם מסוגלים לראות פקעת של חוטים מבלי לראות את החוטים הנפרדים עצמם. כאשר סטפן קרא על פליטה מאולצת, הוא הבין כי ניתן לייצר מעין פנס ננומטרי שיוכל לסרוק את הדגימה, ננומטר אחר ננומטר. באמצעות השימוש בפליטה מאולצת מדענים מסוגלים לגרום לשיכוך הפלואורסנטיות של מולקולות – הם מכוונים אלומת לייזר לעבר המולקולות שמאבדות מיד את האנרגיה שלהן והופכות לשחורות. בשנת 1994 סטפן הל פרסם מאמר המפרט את הרעיונות שלו. בשיטה המוצעת, הנקראת בשם דלדול של פליטה מאולצת (stimulated emission depletion, STED), הבזק אור מעורר את כל המולקולות הפלואורסנטיות, בעוד שהבזק אור נוסף משכך את הפלואורסנטיות מכל המולקולות למעט אלו שגודלן ננומטרי (איור 2). בשלב הבא, רק מולקולות אלו נקלטות. ע”י סריקת הדגימה ומדידה רציפה של רמות האור, ניתן לקבל תמונה מקיפה ומפורטת. ככל שהנפח המקרין את הפלואורסנטיות קטן יותר ברגע נתון, כך כושר ההפרדה של התמונה הסופית גבוה יותר. לפיכך, ובאופן עקרוני, כבר לא קיימת כל מגבלה לכושר ההפרדה של מיקרוסקופים אופטיים.

הפיתוח של הפנס הננומטרי הראשון של סטפן הל בגרמניה

המאמר התיאורטי שלו לא עורר כל מהומה מיידית, אולם הוא היה מספיק מעניין עד כדי שהוצעה לו משרה במכון מקס פלנק לכימיה ביו-פיזיקאלית בגטינגן. בשנים שלאחר מכן הוא הוציא לפועל את הרעיונות שלו ופיתח מיקרוסקופ הפועל על עקרון ה-STED. בשנת 2000 הוא הצליח להדגים כי הרעיונות שלו אכן פועלים כצפוי באופן מעשי ע”י, בין שאר הדברים, ביצוע דימות של חיידק אשריכיה קולי בכושר הפרדה שמעולם לא הושג קודם לכן בעזרת מיקרוסקופיה אופטית (איור 3).

בניגוד לשיטה זו, העיקרון השני שעליו זכו המדענים, מיקרוסקופיה של מולקולה בודדת, כרוכה בשימוש במספר תמונות, זו על גביי זו. וויליאם מורנר ואריק בטזיג תרמו כל אחד מהם, באופן בלתי תלוי, תובנות בסיסיות שונות לפיתוחה של שיטה זו. הבסיס הונח כאשר מורנר הצליח לאתר מולקולה פלואורסנטית קטנה יחידה.
וויליאם מורנר – הראשון לאתר מולקולה פלואורסנטית יחידה

ברוב השיטות הכימיות, לדוגמה במהלך מדידה של בליעה או פלואורסנטיות, מדענים בוחנים מיליוני מולקולות בו-זמנית. התוצאות של ניסויים מסוג זה מייצגות סוג של מולקולה ממוצעת, טיפוסית. המדענים נאלצו לקבל את העובדה הזו, מאחר ולא היה קיים כלי אחר, אולם הם המשיכו לחלום על מדידתה של מולקולה יחידה. זאת לאור העובדה כי ככל שהפרטים רבים ועשירים יותר, כך ניתן להבין טוב יותר תהליכים ביולוגיים, לדוגמה – התפתחותה של מחלה.

לפיכך, כאשר בשנת 1989 מורנר הפך למדען הראשון אי-פעם שהצליח למדוד את בליעת האור של מולקולה יחידה, היה זה הישג פורץ דרך. באותו שלב הוא עבד במרכז המחקר של י.ב.מ. בסן חוזה, קליפורניה. הניסוי שלו סלל את הדרך לעתיד חדש והעניק השראה לכימאים רבים אחרים להסב את תשומת ליבם למולקולות יחידות. אח ממדענים אלו היה אריק בטזיג, שאת הישגיו נציג להלן.
שמונה שנים לאחר מכן מורנר ביצע את הצעד הבא כלפי מיקרוסקופיה של מולקולה יחידה, תוך שהוא מסתמך על התגלית שזיכתה את ממציאה בפרס הנובל – החלבון הפלואורסנטי הירוק (GFP).

נורות מולקולארית נדלקות ונכבות
בשנת 1997 מורנר הצטרף לאוניברסיטת קליפורניה בסן-דייגו, שם ניסה רוג’ר טסיין, חתן פרס נובל לעתיד לבוא, לגרום לחלבון הפלואורסנטי הירוק לזהור בכל צבעי הקשת. החלבון הירוק בודד מתוך מדוזה פלואורסנטית והחשיבות שלו טמונה בעובדה כי הוא מסוגל לגרום לחלבונים אחרים בתוככי תאים חיים להיראות בברור. באמצעות טכנולוגיות גנים מדענים מחברים את החלבון הפלואורסנטי הירוק לחלבונים אחרים. בשלב הבא, האור הירוק מגלה בדיוק היכן בתא החלבון המסומן נמצא.

מורנר גילה כי הפלואורסנטיות של זן אחד של החלבון הפלואורסנטי הירוק ניתן לכיבוי ולהדלקה לפי רצונו של החוקר. כאשר הוא עורר את החלבון בעזרת אור באורך גל של 488 ננומטרים, החלבון התחיל לזהור, אולם לאחר זמן מה הזוהר החל הולך ודועך לו. ללא קשר לכמות האור שהחוקר כיוון לעבר החלבון, הפלואורסנטיות הלכה ודעכה לה עד להיעלמות. אולם, הסתבר כי אור באורך גל של 405 ננומטרים מסוגל להחיות את החלבון. כאשר החלבון הופעל מחדש, הוא שב לזהור באורך גל של 488 ננומטרים.

מורנר שיקע את החלבונים הללו בג’ל, ומיקם אותם כך שהמרחק ביניהם היה גדול מסף ההשתברות של אבה שהיה 0.2 מיקרומטרים. מאחר שהם היו מפוזרים בדלילות, מיקרוסקופ אופטי רגיל היה יכול להבדיל בין ההבהוב של כל אחד מהחלבונים בנפרד – הם פעלו כמו פנסים זעירים בעלי מתגי כיבוי והדלקה. התוצאות פורסמו בשנת 1997 בכתב-העת היוקרתי Nature.

בעזרת תגלית זו מורנר הוכיח כי ניתן לשלוט אופטית בפלואורסנטיות של מולקולות יחידות. הרעיון של מורנר פתר את הבעיה שניסח אריק בטזיג שנתיים קודם לכן.

מיצה את האקדמיה – אולם נותר כפייתי לגביי מגבלת ההשתברות של אבה

בדיוק כמו סטפן הל, אריק בטזיג היה כפייתי באשר להתגברות על מגבלת ההשתברות של אבה. בתחילת שנות ה-90 הוא עבד על מיקרוסקופיה אופטית חדשה בשם near-field microscopy, במעבדות בל שבניו-ג’רזי. במיקרוסקופית שדה-קרוב קרן האור מוקרנת מתוך חוד זעיר במיוחד הנמצא רק מספר ננומטרים מעל הדגימה. גם שיטת מיקרוסקופיה זו יכולה להתגבר על המגבלה של אבה, אך היא גם בעלת חולשות משמעותיות. לדוגמה, האור המוקרן הוא בעל טווח כה קצר עד כי קשה לראות מבנים הנמצאים מתחת לפני השטח של התא.
בשנת 1995 אריק בטזיג הגיע למסקנה כי מיקרוסקופיה זו לא ניתנת לשיפור נוסף. בנוסף, הוא לא הרגיש בנוח באקדמיה והחליט כי הוא מסיים את קריירת המחקר שלו; מבלי שהוא יודע לאן הוא מתקדם משם, הוא פרש ממעבדות בל. אולם, מגבלת ההשתברות של אבה המשיכה לנקר במוחו. במהלך טיול ביום חורף קר עלה במוחו רעיון חדש – האם ניתן להתגבר על מגבלת ההשתברות באמצעות מולקולות בעלות תכונות שונות, מולקולות בעלות פלואורסנטיות בצבעים שונים?

תוך שהוא מקבל השראה ממחקרו של מורנר, בין יתר המדענים, אריק בטזיג כבר הצליח לאתר פלואורסנטיות במולקולה יחידה בעזרת מיקרוסקופיה בשדה קרוב. הוא התחיל לתמוה האם מיקרוסקופ רגיל יוכל להוליד כושר הפרדה גבוה כמו זה במידה ומולקולות שונות יזהרו בצבעים שונים, למשל – באדום, צהוב וירוק. הרעיון שעלה במוחו היה שהמיקרוסקופ יתעד תמונה אחת לכל תבע. אם כל המולקולות בעלות אותו הצבע יפוזרו וימוקמו במרחק העולה על המגבלה של אבה של 0.2 מיקרומטרים, אזי מיקומם ניתן יהיה לאיתור בדיוק רב. בשלב הבא, כאשר יניחו את התמונות הנפרדות הללו אחת מעל השנייה, התמונה הכולל תוליד כושר הפרדה שיהיה הרבה יותר טוב מזה של אבה, ונין יהיה להבחין במולקולות בעלות צבעים שונים אפילו אם הן במרחק של מספר ננומטרים זו מזו. אולם, היו מספר בעיות מעשיות, לדוגמה, העדר מולקולות בעלות כמות מספקת של תכונות אופטיות נבדלות.

בשנת 1995 אריק בטזיג פרסם את הרעיונות התיאורטיים שלו בכתב-העת המדעי Optics Letters, ולאחר מכן פרש מהאקדמיה והצטרף לחברה העסקית של אביו.
הפיתוי לחזור למיקרוסקופיה בעקבות גילויים של החלבונים הפלואורסנטיים הירוקים
במשך שנים רבות אריק בטזיג היה מנותק לחלוטין מקהיליית המחקר. אולם, ביום בהיר אחד תשוקתו למדע התעוררה לחיים שוב ובעודו קורא בספרות המדעית הוא נתקל לראשונה בחלבון הפלואורסנטי הירוק. בעודו מבין כי קיים חלבון המסוגל לגרום לחלבונים אחרים להיראות בתוך התאים, בטזיג החל לגלגל במוחו את הרעיון בעזרתו הוא יוכל להתגבר על המגבלה של אבה. פריצת הדרך האמיתית הגיעה בשנת 2005 כאשר הוא נתקל בחלבונים פלואורסנטיים הניתנים להפעלה ע”י החוקר, בדומה לאלו שמורנר איתר בשנת 1997 ברמה של מולקולה יחידה. בטזיג הבין כי חלבון כזה הוא הוא הכלי שנדרש לו על מנת ליישם את הרעיון אליו הוא הגיע 10 שנים קודם לכן. המולקולות הפלואורסנטיות לא חייבות להיות בעלות צבעים שנים, הן יכולות פשוט לזהור במועדים שונים.

מתגברים על המגבלה של אבה בעזרת הערמת תמונות
שנה אחת בלבד לאחר מכן, אריק בטזיג הדגים, במסגרת שיתוף פעולה עם מדענים שעבדו בעירור של חלבונים פלואורסנטיים, כי הרעיון שלו עבד הלכה למעשה. בין שאר הניסויים שלהם, המדענים קשרו את החלבון הזוהר לקרומית העוטפת את הליזוזום, תחנת המחזור של התא. בעזרת הבזק אור, החלבונים הופעלו והפכו לפלואורסנטיים, אולם כיוון שההבזק היה כה חלש, רק חלק מהן החל לזהור. בשל מספרם המועט, כמעט כל החלבונים נמצאו במרחק שהיה גדול ממגבלת ההשתברות של אבה של 0.2 מיקרומטרים. אי-לכך, ניתן היה לתעד את מיקומו המדויק של כל אחד מהחלבונים במיקרוסקופ. לאחר זמן מה, הפלואורסנטיות דועכת ואז המדענים מפעילים תת-קבוצה חדשה של חלבונים. שוב, ההבזק היה כה חלש שרק חלק מהחלבונים החלו לזהור, ואז מתעדים תמונה נוספת שלהם. כאשר בטזיג ערם את התמונות אחת על גביי השנייה, הוא קיבל בסופו של דבר על-תמונה בכושר הפרדה גבוה של קרומית הליזוזום. הרמה שלה היה טובה ממגבלת ההשתברות של אבה. מאמר שפורסם בכתב-העת המדעי היוקרתיScience בשנת 2006 הציג בסופו של דבר את העבודה פורצת הדרך הזו.

חתני הפרס עדיין ממפים את סודות החיים העמוקים ביותר
השיטות שפותחו ע”י שלושת החוקרים הובילו לפיתוחן של מספר שיטות ננוסקופיות המשמשות היום ברחבי העולם כולו. שלושת הזוכים הם עדיין חוקרים פעילים בקהיליית המדענים ההולכת וגדלה של חוקרים בתחום הננוסקופיה. כאשר הם מכוונים את הננוסקופים העוצמתיים שלהם כלפי הרכיבים הזעירים ביותר של החיים הם גם מספקים לנו באותו הזמן ידע מתקדם ביותר. סטפן הל חיטט בתוככי תאי העצב החיים על מנת להבין טוב יותר את הסינפסות שבמוח. מורנר חקר חלבונים הקשורים למחלת הנטינגטון. אריק בטזיג עקב אחר חלוקת תאים בתוככי עוברים. אלו הם רק חלק קטן מדוגמאות רבות. דבר אחד בטוח – חתני פרס הנובל בכימיה לשנת 2014 הניחו את היסודות לפיתוחו של ידע בעל החשיבות הגדולה ביותר למין האנושי.